RESUMEN: Mariposas del genero neotropical Heliconius forrajean sobre polen. Este es el primer ejemplo conocido de un habito en mariposas que es bien conocido para otros insectos. Las mariposas extraen aminoacidos y proteinas del polen; esta innovacion en la alimentacion juega un rol en la biologia reproductiva y poblacional de estos insectos. Se sugiere que otros animales pueden usar polen en un modo similar.
Se piensa generalmente que los lepidopteros adultos son incapaces de asimilar aminoacidos y proteinas, y que por lo tanto los componentes nitrogenados de sus huevos son derivados solamente de reservas (cuerpo graso) acumuladas como resultado de la alimentacion en el estadio larval (1, 2). Los huevos son, por lo tanto, producidos a expensas del cuerpo graso, y cuando este desaparece no se producen huevos. Recientemente, sin embargo, ha sido descrita una polilla Malaya que se alimenta de sangre como hacen los mosquitos (3). El presente reporte discute la evidencia para un desarrollo analogo en ciertos miembros de mariposas del genero neotropical Heliconius (Nymphalinae), en el cual el recurso de aminoacidos y proteinas para mariposas adultas es polen mas bien que sangre. Estudios ejecutados en el laboratorio, en insectarios, y en el campo indican como los componentes nitrogenados del polen son extraidos por heliconius y como ellos influencian la estrategia reproductiva de estas mariposas.
Areas de estudio
La mayoria de observaciones en el campo fueron hechas en el bosque bajo montano humedo [610 m (2000 ps) elevacion] cerca al Paso Arima, Trinidad y en dos bosques lluviosos de terraza baja en Centro America [0-122 m (0-400 ps) elevacion]: Isla Barro Colorado, Zona del Canal y la Peninsula Osa, Costa Rica. Observaciones adicionales y muchos trabajos experimentales fueron ejecutados sobre la vida de las mariposas, en insectarios protegidos al aire libre (en la estacion de Investigacion Tropical de la Sociedad Zoologica de Nueva York en Simla, Valle de Arima, Trinidad) o en el invernadero de 6.4 x 4 m (21 x 3 ps) en la Universidad de Stanford y la Universidad de Texas, Austin. Las poblaciones del invernadero fueron mantenidas como poblaciones criadas continuamente por mas de 2 anos y la conducta del adulto en recintos similares es en muchos aspectos identicos a los individuos salvajes.
Evidencias para la alimentacion con polen
Numerosas evidencias indican que el polen es colectado por su valor nutritivo y no cogido como un resultado indirecto de visitas al nectar.
(1) Hay una conducta distintiva de polen-colectora. Se ha observado en el insectario a Heliconius erato reuniendo polen permaneciendo en una simple inflorescencia de Lantana camara por un tiempo de 10 min, considerando que tipicamente la visita el nectar tarda no mas de 3 seg. Durante su visita al polen, la mariposa repetidamente raspa la punta de la proboscis sobre las anteras con cortas sacudidas y metidas y raramente encaja al fondo de la corola por nectar.
(2) Otras especies de mariposas no acumulan cargas de polen aun cuando visitan estas flores que proveen polen a un numero de especies de Heliconius. Por ejemplo, durante un estudio (Diciembre 1969-Diciembre 1970) en el Paso Arima, Trinidad, W.I., Heliconius ethilla frecuentemente colectava cargas visibles de polen de Palicorea crocea (Rubiaceae), mientras Parides spp., otra mariposa comun que solamente visita esta flores, no colecto polen. En un insectario en la Universidad de Texas en Austin, Dryas julia y Eueides isabella (ambas heliconiines que no se alimentan de polen), y Heliconius erato todas visitan Lantana camara pero solamente H. erato construye cargas de polen.
Cargas de polen similares a la Fig. 1 han sido observadas en las siguientes especies de Heliconius: erato, melpomene, charitonia, clysonimus, sara, hecale, ethilla, doris, ismenius, sapho, wallacei, cydno, pachinus, y hewitsoni. Eueides, un genero frecuentemente agrupado con Heliconius, no posee especies reunidoras de polen. Lo mismo ocurre para 6 generos de heliconiines y todos los otros grupos examinados del Nuevo Mundo.
(3) Existe una elaborada conducta de procesamiento de polen que empieza con la formacion de una masa seca sobre el lado ventral de la proboscis cercana a la cabeza. Luego, un liquido claro (probablemente nectar) es exudado de la punta de la proboscis y es mezclado con el polen. Posteriormente, la carga humeda de polen es agitada por varias horas a traves de un enrollamiento y desenrollamiento de la proboscis.
(4) Caracteristicas morfologicas de la proboscis relacionados con las funciones descrita arriba. La papila sobre la punta de la proboscis (Fig. 2A) probablemente actua como receptor quimo-mecanico ademas de funcionar como un cepillo para rescatar polen. Algunos insectos que no se alimentan de polen como Papilio y Danaus carecen completamente de esta papila (Fig. 2C), mientras que en otras (como numerosos generos de nymphaline) la papila esta orientada y agrupada diferentemente como si sirviera a una funcion diferente (L. Gilbert, observaciones no publicadas). Largos pelos mecano-receptores cercanos a la cabeza pueden proveer accion concerniente a la forma y tamano de carga de polen (Fig. 2B). Estos pelos son menos desarrollados en todas las especies examinadas que no se alimentan de polen. Las polillas alimentadoras de sangre han desarrollado caracteristicas morfologicas similares que correlacionan con los habitos alimenticios (4).
(5) Experimentos con flores artificiales en un insectario en Stanford demostraron que Heliconius erato tiene igual preferencia para polen y cuentas de vidrio que simulan polen. En un experimento de seleccion, en un insectario con Heliconius fueron arregladas 25 flores artificiales en grupos de 5 que contenian polen seco, cuentas de vidrio, un extracto de sucrosa de polen, 15 % sucrosa, y agua. Una video grabadora puesta en lapsos de tiempo de 20,000 seg. permitio la grabacion de visita para el analisis de las visitas. El primer dia, el promedio de visita en segundos fue 40, 40, 21, 34, y 9, mientras que el procentaje del tiempo total de visitas fue 32, 21, 17, 17, y 3 por polen, cuentas de vidrio, extracto de polen, sucrosa y agua respectivamente. En dias siguientes las mariposas parecieron diferenciar entre polen y cuentas de vidrio, pero estos aun recibieron un alto porcentaje del total de visitas que las otras "flores" que no poseian polen. Ademas, los grupos de cuentas de vidrio fueron colectadas y tratadas exactamente como si ellas fueran grupos de polen. Esto elimina la posibilidad que las mariposas toman polen involuntariamente por algun mimetismo quimico del nectar. Detalles de este experimento aparecera en otra parte.
(6) Experimentos de Linskens y colaboradores mostraron que ciertos polen liberarian activamente muchas de sus proteinas y aminoacidos libres dentro minutos de ser incubados en solucion de sucrosa (5, 6). Durante el primer minuto cuando se incubo a 25ˇ y solucion de sucrosa al 10% granos de polen vivos liberaron 50% de aminoacidos. Polen con una concentracion total de aminoacidos pregerminados de 2.56 µmol/mg de polen, libero 560 nmol de aminoacidos dentro de una solucion de sucrosa despues de 2 hr de incubacion. Durante la germinacion hay una sintesis de aminoacidos del polen.
Debido a esta caracteristica de fisiologia del polen, la ingestion y/o digestion enzimatica no son requeridas para que las mariposas sean capaces de remover estos componentes. En efecto, cuando grupos de polen humedo fue removido de Heliconius en el insectario y sus proteinas fueron analizados por electroforesis, se encontro que ellos contienen solamente enzimas de polen; no fueron detectadas enzimas del intestino de las mariposas. [Grupos de polen fueron inmediatamente suspendida y centrifugada en solucion de sucrosa fria al 15%. Las proteinas del sobrenadante fueron separadas por electroforesis sobre geles de acrilamida discontinua (EC Apparatus Corp., Philadelphia, Pa., Technical Bulletin no. 140), los cuales fueron tenidos con leucina aminopeptidasa (EC 3.4.1.1) y esterasas no especificas. Igualmente el contenido estomacal e intestinal de las mariposas fueron analizadas por la misma enzima.]
(7) Para ver si los aminoacidos ingeridos por Heliconius adulto estaban relacionada directamente en la produccion de huevos, corri el siguiente experimento: Durante 8 dias, 15 hembras de Heliconius erato fueron alimentadas con suficiente cantidad de aminoacidos [14C] para aproximar la ingerencia de esos aminoacidos en los dias de maxima ingerencia de polen [bajo condiciones de campo (1.5 mg)]; asumiendo un periodo de incubacion de 2 hr. Despues de 2 hr de incubacion, se liberaron 1 mg de polen germinado 3.3, 3.3, 4.4, y 6.0 nmol de arginina, leucina, lisina y valina, respectivamente (6).
Los huevos fueron colectados 6 dias antes, y 8 dias despues del 8-dia durante el cual se administro la marca. La produccion de huevos de cada dia fue tratada con una solucion debil de cloro para remover las proteinas de glandula accesoria y clorion, homogenizado en fluido centellado (Aquasol, New England Nuclear Corp.), y contado. Los resultados graficados como cantidades promedios por minuto, por huevo versus dia, indica que la absorcion de aminoacidos libres dentro de los huevos en desarrollo son rapido y sorprendente (Fig 3). Esto no es inesperado en insectos, tal como muchas especies de Heliconius , los cuales producen huevos maduros con diminutos oocitos en pocos dias. Por ejemplo, en un tiempo dado, cada ovariola de Heliconius erato contiene 6-7 oocitos visibles, los mas grandes madurarian en un tamano de 0.50 a 0.65 mg huevo por dia, los mas pequenos estan sobre los 80 µm de diametro.
Es interesante hacer notar que los lepidopteros son conocidos por transferir proteinas foraneas inalteradas inyectadas de hemolinfa dentro de huevos desarrollados por pinocitosis (7), sugiriendo que los aminoacidos libres serian transferidos en proporcion a su concentracion en la hemolinfa.
(8) En un experimento realizado en un insectario al aire libre en Trinidad se comparo la produccion diaria de huevos de 5 hembras de Heliconius ethilla que se alimentaron con una dieta de nectar y polen despues del dia de su emergencia (Grupo I) con 5 hembras que se alimentaron solamente de nectar (Grupo II). El grupo I promedio 6.25 huevos por dia durante los primeros 5 dias de produccion de huevos. Durante los 5 dias despues cuando ceso la alimentacion de polen las producciones individuales de huevos fueron 28, 32, 24, 23, y 21 para un total de 128 huevos. Grupo II (5 insectos) estuvo al mismo tiempo en otra jaula sin polen; la produccion de huevos durante los primeros 5 dias fue 3, 5, 4, 4, y 7 por un total de 23 huevos. Asi, el grupo polen-alimentador promedio 5 veces mas huevos por dia, durante y despues de 5 dias, del periodo de alimentacion de polen que los que fueron producidos durante los 5 primeros dias de produccion de huevos por el grupo que nunca recibio polen.
Alimentacion de polen y biologia de Heliconius
Varios aspectos en la biologia de vida y reproduccion de Heliconius polen-colectoras son consistentes con la hipotesis que los nutrientes proveidos de polen son de mayor importancia al mantenimiento y a la actividad reproductiva del adulto. Evidencia para 3 especies indican que estas pueden poseer la actividad mas larga en el lapso de la vida adulta para mariposas, con individuos que frecuentemente viven 6 meses ya sea en insectarios (Gilbert, no publicado) y silvestres (ref. 8, Ehrlich y Gilbert, no publicados). El problema de obtener un recurso regular de energia para el vuelo puede ser parcialmente explicado primero, por la abundancia de prolina, la cual constituye cerca del 50% de aminoacidos libres en polen (6) [prolina es un importante componente de energia almacenada en la hemolinfa y musculos para el vuelo de insectos (9, 10)], y segundo, por la habilidad de aprovechar polen, el cual es suplido como un porcentaje constante a traves de la longevidad de un Heliconius debido a un rasgo especial de las plantas que proveen polen (8).
La alimentacion de polen tambien ayuda a explicar el patron de reproduccion visto en muchas especies de Heliconius. A lo largo de su larga vida, la produccion diariamente de huevos de una hembra de Heliconius continua relativamente constante, porcentaje bajo, y varia de 1-4 huevos (Heliconius erato, melpomene) a 7-10 huevos (H. ethilla). Por ejemplo, el numero de huevos maduros de Heliconius erato encontrados en una serie de insectario fue 0, 0, 4, 1, 4, 3, 5, 4, y 4 para hembras de edad 0, 1, 14, 39, 53, 74, 84, 100, y 182 dias respectivamente. Hembras de Heliconius ethilla colectadas en el campo que eran reconocidas (por marcaje) a tener 4 meses de edad, depositan huevos en un porcentaje igual a las hembras de laboratorio menores de 20 dias. Este patron es un notable contraste a especies como la nymphaline Euphydryas editha, la cual deposita cientos de huevos durante los primeros dias de vida adulta y vive no mas que 3 semanas en la vida silvestre (11). Por la alimentacion de polen, la masa total de huevos producidos por Heliconius probablemente iguala y puede sobrepasar a la de Euphydryas. Contraria al estimado de Labine (11) que fueron basados sobre datos inadecuados.
Tanto machos, como hembras, sostienen actividad reproductiva a lo largo de su vida eso fue evidenciado por el apareamiento satisfatorio de un macho salvaje H. ethilla (no. 438) con una hembra virgen 120 dias despues de su captura en la poblacion de Paso de Arima. Por otro lado, el bajo porcentaje de hembras virgenes reclutados en poblaciones de Heliconius (8) no requeriria que la produccion diaria de espermatoforos proveniente de un macho sea el equivalente energetico en la produccion de huevos por la hembra para tener exito reproductivo. Esta sugerencia es apoyada por el hecho que las hembras llevan consistentemente la mas grande cantidad de polen (ver Fig. 1) en el campo, mientras que ambos sexos recogen grandes cantidades cuando estan rodeados de abundancia de polen. Datos colectados en un ano (1970) en el Paso de Arima en poblaciones de H. ethilla muestran que el 95% (N = 43) de todas las cantidades n. 3 (en escala de 0-3) observadas fueron tomados por hembras, a la misma vez solamente 34% (N = 794) de los insectos capturados fueron hembras.
Otras mariposas de clima tropical y templado pueden tener longevidad adulta incrementada y la fraccion adulta de esfuerzo reproductivo total para explotar otros recursos de componentes nitrogenados. Por ejemplo mariposas ithomiine se alimentan de excremento fresco provenientes de aves en adicion al nectar (15), y estudios de marcaje en Trinidad indicaron que por lo menos, 2 especies (Ithomia pellucida e Hypothyris euclea) viven por lo menos 4 meses (L. Gilbert, no publicado). Especies Charaxine y Nimphaline como Charaxes, Anaea, Historis, Prepona, Adelpha, Marpesia, Asterocampa, Caligo, etc son conocidas a alimentarse de fruta podrida, orina y excremento. Puede tambien ser posible que bajo circustancias especiales su nectar contenga aminoacidos, aunque un chequeo sistematico para componentes nitrogenados en el nectar no ha sido ejecutado (16). Mientras estos recursos de nitrogeno en la dieta adulta pueda suplir los componentes almacenados en el estado larval, ninguno de ellos son probables a suplir los recursos concentrados de los 10 aminoacidos requeridos por insectos que se proveen de polen (arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, y valina). Por ejemplo, el porcentaje de aminoacidos libres en platanos (17) es sobre 1/120 de lo encontrado en polen (6), y numerosos aminoacidos importantes son ausentes en los platanos. La facilidad con la cual Heliconius puede extraer componentes nitrogenados del polen provee una razon para reexaminar el significado de la digestion de polen para otros insectos como abejas de miel y moscas sirfidos que son conocidas requieren polen en la dieta adulta para la produccion de cuerpo graso (18) y huevos (19) respectivamente. En verdad, otros animales nectar-alimentadores como murcielagos y picaflores los cuales obtienen nitrogeno a traves de insectos que ocasionalmente ellos comen, estan completamente apertrechados a usar polen como lo hacen las mariposas. Esta posibilidad es fortalecida por el hecho: por lo menos algunos picaflores son conocidos a ingerir polen (R. K. Colwell*, conversaciones personales), y murcielagos nectarivoro son frecuentemente atrapados con el intestino atiborrados de polen.
Ya que el recurso colectado por el adulto es importante en prolongar la longevidad como bien mantener porcentajes optimos de reproduccion por Heliconius , la cantidad y distribucion de este recurso en el espacio y tiempo es una llave importante al entendimiento de la estructura y dinamica de las poblaciones de Heliconius (8) como tambien ciertos aspectos de la estructura de la comunidad y de diversificacion evolucionaria de heliconiine. Jusgando por la observacion que la alimentacion con polen es restrictiva al simple genero Heliconius , y por la aparente ubicuidad del habito en el genero, esta innovacion en la alimentacion adulta puede haber sido el paso desicivo en la divergencia de este grupo desde el linaje primitivo de heliconiine.
Ademas, el desarrollo de la alimentacion de polen en un insecto incapaz de masticar o ingerir polen incrementa la probabilidad que las plantas envueltas serian capaces de tomar el primer paso coevolutivo principal a la relacion mutualistica con los insectos. Algunas de las plantas conocidas a estar implicadas en tal relacion con Heliconius (L. Gilbert, no publicado), son resumidas aqui: Anguria triphylla, A. umbrosa, Gurania spinulosa, (todas Cucurbitaceae) Palicourea crocea, Cephaelis tormentosa, (ambas Rubiaceae), Trinidad; A. warcewiczii, A. sp., Gurania levyana, Cephaelis tormentosa, Costa Rica; A. warcewiczii, Panama; y numerosas especies de plantas relacionadas en todas partes de los tropicos del Nuevo Mundo. Estas plantas, de las cuales todas proveen polen en un limite pero con porcentaje constante a traves del ano, son factores importantes en "fabricar" Heliconius por ano alrededor de caracteristicas de muchos bosques neotropicales; y como estas plantas incrementan la predictibilidad y estabilidad del habitat para la mariposa, la mariposa como agente polinizador, llega a ser importante y recurso predictible para las plantas. Detalles de evidencia para mutualismo entre Heliconius y el polen de las plantas sera reportado mas adelante.
Amigos de Stanford, en particular H. Edenberg, C. Gilbert, J.B. Johnson, P.A. Morrow, D. Muchmore, and M.C. Singer proveyeron asesoramiento y ayuda con aspectos de este trabajo. M.J. Mitchell de Kent Cambridge Scientific Inc., Palo Alto, Calif. proveyeron facilidades y ayuda con el trabajo de microscop’a electronica. El trabajo de campo en Costa Rica fue realizado conjuntamente con labores de ense–anza en el curso de la Organizaci—n de Estudios Tropicales, Julio-Agosto 1971. R.H. Barth, K.S. Brown, Jr., D.H. Feener, and C.T. Jordan amablemente leyeron y criticaron el manuscrito. Este estudio es una investigaci—n adicional al trabajo conducido en Trinidad con P.T. Ehrlich y patroncinado por sus becas con la N.S.F. GB-19686 y GB-22853x.
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*Department of Zoology, University of California, Berkeley, Calif.
Fig. 1 Heliconius ethilla (no3) con una carga grande de p—len colectada en menos de 3 min a partir de una flor masculina de Gurania spinulosa cerca del Paso Arima, Trinidad.
Fig. 2(A) Punta de la proboscis de Heliconius ethilla mostrando la papila terminal. Escala: 0.1mm: X 160. (B) Carga de polen en la proboscis del H. melpomene. Pelos mecano-receptores son visibles cerca del encabezamiento de la fotograf’a (flecha). La cabeza de la mariposa est‡ a la altura derecha de la foto. Escala: 0.1mm: X 165. (C) Punta de la proboscis del Danaus plexippus mostrando ausencia de papila. Escala: 0.1mm: X 200.
Fig. 3 Incorporaci—n de amino‡cidos libres en [14C] dentro de los huevos de Heliconius; cpm por huevo es graficado contra dias. Los compuestos marcados fueron administrados desde el dia 6 hasta el dia 14 (lineas punteadas).